Die Küvette (Abbildung 4) besteht aus Teflon. Zwei Abteilungen sind durch eine 1mm dicke Wand getrennt. Jede Abteilung hat ein Volumen von ca. 6ml. Da die gesamte Küvette aus einem Block hergestellt wurde, gibt es keine Leckströme wie bei zusammengesetzten Meßzellen. Die dem Mikroskop zugewandte Abteilung ist mit einem Quarzglasfenster abgeschlossen. In der Mitte der Trennwand befindet sich die Bohrung, über der die Lipidmembran hergestellt wird. Bis ca. 100m vor dem Durchbruch auf die andere Seite ist sie als Zylinderbohrung des Durchmessers 1,5mm ausgeführt. Dann wurde mit einem Kugelkopfbohrer weitergearbeitet. Dadurch entstand ein Loch mit 0,75mm Durchmesser und extrem dünnen Rändern.
Als kleinste Ausgangsspannung des Pulsgenerators sind 500mV angegeben. Benötigt wird der Bereich von 20 bis 600mV. Deshalb ist vor die Diode ein 20dB Abschwächer geschaltet. Mit seinem 50 Abschlußwiderstand gegen Masse garantiert er nach BNC-Spezifikation die korrekte Übertragung des Signals vom Pulsgenerator und das schnelle Aufladen der Membran.
Erste Tests wurden mit Kondensatoren an Stelle der Meßzelle durchgeführt. Mit 1nF lag deren Kapazität im Bereich der Kapazität der zu untersuchenden Membranen. Kapazitätsmessung mit der Ladungspulsmethode (siehe Abschnitt 3.9) bei einem 100pF Kondensator ergaben Werte, die 14pF über den Meßwerten des Impedanzanalysators lagen. 14pF entsprechen der Kapazität der passiven Probe des Oszilloskopes. Von anderen Gruppen werden einfache Operationsverstärker zur Einkopplung des Oszilloskopes in den Meßkreis verwendet. Das Meßsignals wird verstärkt. Man erhält ein besseres Signal zu Rausch Verhältnis. Hoher Eingangswiderstand bedingt aber niedrige Grenzfrequenz des Operationsverstärkers und damit Verfälschungen bei hohen Frequenzen. Große Anstiegszeiten verdecken wichtige Informationen schneller Prozesse. Zum Erreichen von Eingangswiderständen über 10M oder zum Treiben des 50 Eingangs des Oszilloskopes habe ich auf Operationsverstärker zurückgegriffen.
Von ca. 8cm Silberdraht, Durchmesser 1mm, werden einige cm auf eine Holzschraube gewendelt. Oxidschichten sind vorher zu entfernen. Zur Reinigung mehrere vorbereitete Stücke 20min in NH conc. kochen. Danach gut mit destilliertem Wasser spülen. Nach 20s Ätzen in HNO conc. sofort beschichten. Dafür bereitet man 0,01M HCl vor. Als Gegenelektrode im Galvanisierprozeß dient gewendelter Platindraht mit eingefügtem 1k Widerstand. Zur weiteren Reinigung 20s Pt+/Ag-, ca. 20mA, Chlorierung 20-25min Pt-/Ag+, 6mA. Die Lösung sollte während der Beschichtung gerührt werden. Der Vorgang wird beendet, wenn alle Elektroden gleichmäßig grau belegt sind. Die Silberdrähte sind während der Prozedur gegebenenfalls mehrmals zu wenden. Danach kann man die Elektroden füer 30h in 0,01M HCl im Dunkeln altern.
Dieses Lipid ist in einem weiten Bereich um die Raumtemperatur herum in der fluiden Phase. Es wird synthetisiert und liegt in hoher Reinheit vor. Chemische Stabilität und Gehalt an Fremdstoffen wurden von Jos Brouwers (Universität Utrecht) untersucht. Eine Probe neu gekauften Lipides und eine Probe von mir während eines Jahres gebrauchten Lipides verglich er an seiner HPLC-Anlage (Abbildungen 6 und 7).
Das Lipid mußte für die Untersuchung aufbereitet werden. Im ersten Schritt wurde es derivatisiert. Danach betrachtet er das zeitliche Erscheinen von Komponenten nach einer vorgegebenen Wegstrecke über die HPLC-Säule Merck RP18. Unterschiedliche Bestandteile haben unterschiedliche Laufzeiten.
Auf der Zeitachse vor 5min liegt Derivat ohne Fettsäureanteile. Bei 20min liegt ein Peak von Fettsäuren mit 1 oder 2 fehlenden Methylgruppen. Alle anderen Unreinheiten sind eher auf das Decan zurückzuführen, lassen sich jedenfalls nicht genau aufschlüsseln. Nach diesen Untersuchungen haben wir ein Decan verwendet, das als Fluoreszensstandart zugelassen war (Fluka).
In [19] wird eine Methode beschrieben, Actinmonomere an einer Membranoberfläche zu polymerisieren. Dabei interagiert Actin direkt mit positiv geladenen Lipiden. Die Menge polymerisierten Actins ist proportional zur Oberflächendichte der positiven Ladungen. Als Mischung zur Herstellung der Membran benutzten wir 90% DPh-PC, 10% Stearylamine in Decan. Stearylamine ist der Trivialname von Octadecylamine, . Bei höheren Zusätzen von Stearylamine werden die in [19] verwendeten Liposome instabil, so daß keine aussagekräftigen Vergleichswerte vorliegen.
Die Versuche mit Actin wurden wie in den Abschitten 3.8 und 3.9 beschrieben durchgeführt. Als Elektrolyt verwendete ich die in Abschitt 3.6 vorgestellte Lösung. Nach mehrmaliger Kapazitätsmessung gab ich wenige l Actinstammlösung in eine Abteilung der Küvette. Die Actinkonzentration in dieser Abteilung betrug 88nM. Ohne zu rühren diffundierten die Actinmonomere an die Membran. Durchbruchsmessungen führte ich nach einer halben Stunde Wartezeit aus.
Glaswaren und Küvette wurden bei Wechsel des Lipids mit DMSO ausgewaschen. Zur täglichen Reinigung und nach der Behandlung mit DMSO spülte ich die Arbeitsmittel mehrmals abwechselnd mit destilliertem Wasser und Ethanol. Bis zum nächsten Gebrauch lagerten Glaspipetten, Probengläschen und Meßbecher bei 130C im Trockenschrank. Zur Auftragung der Lipidlösung zum Vorbereiten der Meßzelle (siehe Abschnitt 3.8) verwendete ich Hamiltonspritzen. Diese wurden mit Decan und Ethanol gespült. Die Küvette wurde vor den Versuchen für zweimal eine halbe Stunde mit destilliertem Wasser gefüllt. Oberflächenaktive Stoffe sammeln sich an der Wasser-Luft-Grenzfläche und können abgeschüttet werden.
Das Experiment setzt sich aus zwei Teilen zusammen. Kapazitätsmessung und Durchbruch. Nach dem Ziehen der Membran beobachtet man optisch das Ausdünnen des Lipidfilmes. Es bilden sich Newtonsche Farbverläufe aus, wie sie von dünnen Schichten bekannt sind (Abbildung 10).
Während des Ausdünnens auf ca. 6nm, was der Länge zweier Lipidmoleküle mit eingelagertem Decan entspricht [11], kommt es zu destruktiver Interferenz zwischen an der ersten und an der zweiten Wasser-Öl-Grenzfläche reflektiertem Licht. Daher der Name ``Black Lipid Bilayer''.
Nun mißt man mehrmals die Kapazität des Filmes. Dazu lädt man die Membran mit einem kurzen Spannungspuls auf ca. 70mV, und wertet die Entladungskurve aus. Um meine Daten mit [18] vergleichen zu können, habe ich mit Pulslängen von 20s gearbeitet. Die Abhängigkeit des elektrischen Durchbruchs von der Pulslänge ist in [3] beschrieben. Hat die Membran ihre größte Kapazität erreicht, erhöht man vorsichtig die Pulsspannung. In jeder neuen Einstellung pulse ich 7 bis 10 mal. Dabei kommt es ab einer kritischen Spannung zum Durchbruch.
Nach der Datenübertragung auf den Computer (siehe Abschnitt 5.3) können die Kurven ausgewertet werden.